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蛋白质和多肽类药物的聚乙二醇结合物——新型给药系统(上)
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2011-9-29          ★★★【字体:

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蛋白质和多肽类药物的聚乙二醇结合物——新型给药系统(上)

 蛋白质和多肽类药物主要包括酶、细胞因子等一些具有特殊功能的蛋白质。现代基因工程的手段使得人们能够大量获取所需的蛋白质,但由于天然或重组的未经任何修饰的蛋白质类药物易引起机体的免疫反应,以及在体内的半衰期较短等原因而减弱了其临床效果,也大大限制了它们的使用。1997年,Abuchowski等证明:作为治疗药物,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰的蛋白比未修饰的蛋白更有效。 PEG修饰的蛋白质(亦称蛋白质的PEC化)包括PEG与蛋白质和多肽类药物的物理结合物和化学修饰物,可改变蛋白质药物的一些性质如:①增加此类药物的溶解度和稳定性。② 减弱或消除免疫原性、抗原性和毒性。③改善药物的体内药动学性质,增加药物在体内的半衰期。④增加药物的治疗指数、扩大临床使用等。目前此项研究主要集中在PEG与蛋白质的化学结合,且已在蛋白质药物研究中广泛应用,现将国内外的有关研究及进展综述如下。

  1 腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)

  ADA的缺乏可导致严重的综合性免疫缺陷症。一些儿童由于先天遗传的原因而缺乏此酶,治疗的方法有骨髓移植和体外摄人ADA。Hershfield首次用PEG-ADA来治疗 ADA缺乏的患者,其长期研究工作表明PEG-ADA的半衰期显著延长,它几乎能完全纠正ADA缺乏患者体内的代谢异常状况,使患者的免疫功能得到不同程度地恢复,而且患者的耐受性好,没有过敏反应。PEG-ADA已获FDA批准用于多种严重免疫缺陷病,同时又可为没有相同人白细胞抗原(HLA)配型的骨髓提供者而无法进行骨髓移植的患者用作替代疗法。它也常作为对ADA缺乏患者进行体细胞基因疗法时的一种重要的辅助治疗手段。

  2 天冬酰胺酶(asparaginase,ASP)

  大肠杆菌(E.Coli)来源的Mr为136000的L-ASP,在国外已用于急性淋巴性白血病和淋巴肉瘤的治疗。它的血浆半衰期短,可引起程度不一的不良反应。Ashihara等用 PEG-500修饰ASP,当其表面氨基总数的73%-92%被修饰时,其血清样本中抗ASP结合力可完全丧失,而其酶活性的 7%被保留且能抵御胰蛋白酶的作用。周笑艳等用琥珀酸酐及琥珀酰亚胺两步活化的单甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethylene glycol,mPEG)对L-ASP进行化学修饰,修饰反应的酶活回收率保持在40%以上,修饰酶的抗热、抗胰蛋白酶水解能力有所提高,抗原性显著下降。曹淑桂等采用氰尿酰氯活化mPEG-5000,得到氰尿酰氯分子上的两个氯为mPEG所取代的分枝状PEG衍生物。在底物保护下,采用这种活化的PEG来像饰L-ASP,当酶分子上的51个氨基被修饰时,ASP的抗原性完全消除,而酶活性仍保持了原来的30%。Enzon和Rhone-Poulenc Rorer公司的抗癌药On caspar(PEG-L-ASP)分别在俄罗斯和美国面市,尤其适用于对天然L-ASP过敏的成人急性淋巴细胞白血病患者的治疗。 Holle对已有的有关PEG修饰ASP的工作进行了综述,有关资料表明:对于某些对由E.Coli和欧文氏胡萝卜软腐菌(Erwinia carotovora)获得的L-ASP有临床过敏反应的患者来说,PEG修饰的ASP是一种安全而有效的L-ASP替代药物。近几年,新的梳状PEG衍生物分子(combed-shape PEG)PM13 (Mr≈13,000)和PM100(Mr ≈100,000)也被用于蛋白质的修饰。与线状的PEG1和分技状的PEG2相比,PM修饰的ASP 在较低修饰程度时即能降低免疫反应性,同时保留较高的酶活性。实验鼠先给以PM13-ASP后再给以未经修饰的ASP,发现抗ASP抗体的产生被完全抑制。给鼠单次静脉注射 PM100-ASP和未经修饰的ASP后,测得两者的半衰期分别是 50h和1.5h,单次给药11d后仍能检测到血清中PM100-ASP 的活性。

  3 白介素-2和白介素-6(interleukine2,6,IL-2,-6)

  IL-2是一个糖基化的Mr约15000的淋巴因子。它能促进T淋巴细胞增殖,并激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK cell),是目前免疫疗法中重要的细胞因子,但其水溶性差,生物活性不稳定,分子量小且血浆半衰期短,体内作用时间短而影响了疗效。基因工程菌株生产的重组IL-2(rIL-2)是非糖基化蛋白,但生物活性与天然IL-2相当。Katre等报道了 PEG活性酯分子修饰的重组人IL-2(PEG-rhIL-2),其溶解度增加,血浆半衰期延长,在Meth A肉瘤鼠体内的抗肿瘤活性也得到增强。王立夫等用PEG-5000活性酯修饰rIL-2,并对修饰后的rIL-2进行复性,由此得到Mr为25000,生物活性保密69.7%的PEG-rIL-2。这种PEG-rIL-2保持激活LAK细胞的能力,且其激活的LAK细胞对K562和BEL-7402细胞的杀伤作用相当、甚至强于rIL-2。郑宝胜等用氰尿酰氯活化的 PEG修饰rIL-2制得了PEG-rIL-2,其生物活性基本不变,而抗原性降低。冯学胜等比较了PEG-rIL-2与rIL-2小鼠体内的抗肝癌活性,结果前者明显延长了肝癌腹水瘤小鼠的生存期,明显抑制肝癌细胞向肺部转移,局部注射后可明显抑制肝癌皮下结节的形成。这说明PEG-rIL-2在肝癌的过继免疫治疗中具有潜在价值。Goodson等则成功地进行了rIL-2 的定位PEG修饰。他们将天然rIL-2糖基化位点——N端第 3位的苏氨酸突变为半胱氨酸,然后用PEG-马来酰亚胺对这个半胱氨酸进行修饰,修饰后的分子具有和未经修饰的分子完全一样的生物活性。该方法在对药用蛋白特异位点的修饰上具有普遍的适用性。
  天然IL-6具有促血小板生成的活性,但同时也会引起剂量依赖性的血浆中IgG水平的上升。Tsutsumi等到通过PEG 修饰获得了54%的氨基发生PEG化的中等分子量的PEG-IL- 6(MPEG-IL-6)。与天然IL-6比较,其血浆半衰期是天然IL-6 的100倍,其体外生物学活性保留了51%,而其体内促血小板生成的作用比天然IL-6高出500倍,且不舍引起IgG合成的增加,避免了负反应的发生。

  4 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,INF)

  肿瘤坏死因子一般即指肿瘤坏死因子α(INF-α),其活性形式为一Mr约5100的同源三聚体。TNF-α是一种与炎症发生有关的细胞因子,对于许多肿瘤细胞都有直接或间接的杀伤作用,但其体内的清除速度快而且高剂量使用时会导致严重的负反应。Tsutsumi等用琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺两步活化的PEG分子(Mr=5000)来共价修饰INF-α,并用凝胶层析法将PEG-TNF-α按分子量大小分为高(HPEG- TNF-α)、中(MPEG-α)、低(LPEG-INF-α)3个组分,其赖氨酸侧键氨基被PEG修饰的程度分别为71%,56%和29%。修饰后TNF-α的体外生物活性下降而血浆半衰期大大延长。三者之中,MPEG-TNF-α的体内生物活性比天然TNF-α提高了约100倍。在单剂量静脉注射给药下,荷瘤小鼠体内的瘤块明显受到抑制,而在多剂量静脉注射给药下,荷瘤小鼠体内的瘤块则完全退化,两种给药方式对实验动物都没有明显的副作用。以上结果显示了PEG-TNF-α作为一种系统性抗肿瘤药物的潜力。Tsunoda等对INF-α的PEG修饬方法进行了改进,即在与PEG反应前加入二甲基马来酸酐,它是一种受pH值影响的可逆性氨基保护剂,在碱性条件下和氨基发生共价交联,在酸性条件下又解高下来。该方法得到的中等分子量PEG-TNF-α(与上述MPEG-INF-α分子量近似),其体内活性是上述MPEG-TNF-α的2倍。

  5 集落刺激因子(colony-stimulating factor,CSF)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)和巨核细胞生长发育因子(megakary ocyte growth and development factor,MGDF)

  CSF包括粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulat ing factor,G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulo cyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-SCF)。G-CSF,Mr 为19000左右,可诱导造血干细胞的增殖和分化,导致血液中的中性粒细胞数目增加,另外它还能刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释出并激活中性粒细胞的功能,常用于治疗团化疗或先天原因导致的血液中中性粒细胞数目减少等症。G-CSF的毒性较轻,半衰期短。Sharon等用Mr分别为5000,10000, 12000和20000的PEG合成了一系列分子虽不等的PEG修饰的突变G-CSF(这种突变G-CSF其Thr-1,Leu-3,Gly-4,Pro-5和 CyS-17分别被替换为Ala,Thr,Tyr,Arg和Ser,其体外和体内活性约是具有天然序列的重组G-CSF的2-3倍)。用G- NFS-60细胞测其体外活性,结果表明,修饰后;C-GSF的体外活性与修饰用的PEG的分子量之间呈负相关关系,而通过血细胞计数方法得到的结果表明其体内活性与修饰用的PEG 的分子量之间呈正相关关系。Niven等合成了2种Mr的 PEG-G-CSF(P1,815000和P2,146800)并研究了rhG-CSF和2 种PEG修饰的G-CSF对鼠肺部给药的情况。研究结果表明 PEG修饰的G-CSF能产生更强烈而持久的白细胞反应,作用强弱顺序是P2>P1>rhG-CSF。P1和P2的体内清除速率与各自的PEG化程度呈负相关关系。PEG修饰GM-CSF的一个有趣的现象是它对多核性中性粒细胞引发功能和集落刺激功能发生分离,前者在PEG对修饰后增强,而后者保持不变或减弱,说明用PEG修饰某些蛋白质分子可精细地改变其生物活性范围,从而开辟新的临床应用范围。
  Malik等用基于tresylated mPEG(TMPEG,M=12000)的生物性优化PEG修饰系统(FIDtoMallCm)来修饰糖基化的 EPO,并研究了它的效力。对Balb/c鼠进行一周一次的 PEG12000-EPO(1μg·kg-1)肌注,以未经PEG修饰的EPO或单甲氧基PEG处理的EPO为对照,结果显示鼠的血细胞比容积保持一持续的上升状态,停止给药后,血细胞比容积减少,但在最后一次注射给药后7.5周内仍然比对照高。而其血浆半衰期增加到29h,而且19d后血液中仍能检测到EPO。这说明EPO用PEG修饰后确实能提高其原有活力。
  MGDF是促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)的截短形式的分子,在体外能诱导巨核细胞集落的形成,在体内具有促进血小板生成的作用。PEG修饰的rhMGDF在动物试验和人体临床试验中获得的良好药动学和药效学行为已有多次报道。Harker等发现PEG-rhMGDF对于HIV感染引起的黑猩猩体内血小板减少症有治疗效果,皮注PEG-rhMGDF后,外周血中血小板数增加10倍,骨髓中巨核细胞数和巨核细胞母细胞数分别增加30倍和4倍,另外中性粒细胞也有增加,而病毒量没有显著增加。Guerra等的研究证明PEG修饰可阻止体外条件下rhMGDF从N末端的降解,这种降解是从其N末端头两个氨基酸的非酶促环化反应开始的。

  6 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)

  大多数氧自由基在头部创伤部位的脑血管壁处存积时可造成神经元损伤、局部缺血性神经元损伤和血管损伤,从而导致血管痉挛。SOD是一类催化超氧阴离子歧化反应的金属酶,它可对抗脑或心脏由于缺血后再灌注造成的损伤,是一种很有前途的药用酶。现在常用的SOD是牛来源的 SOD,该酶包含2个亚基,每个亚基由151个氨基酸组成,锌离子和铜离子作为其辅酶。但该酶有生物半衰期短,异体蛋白免疫原性和患者不易吸收利用等缺点,因而限制了其临床应用。PEC的共价修饰能解决这些问题。
  Beauchamp等用1,1’-碳酰二咪唑(1,1’-carbonyldiimi dazole)活化PEG修饰SOD,偶联物活性达到95%时的修饰程度下:其血浆半衰期由原来的3.5min延长至约9 h,甚至更长。国外还有报道PEG修饰后的SOD其血浆半衰期可延长到30h以上。区耀华等用氰尿酰氯活化PEG修饰SOD制得均一的PEG-SOD聚合物,酶活性为天然SOD的75%。王继华等用氰尿酰氯活化mPEG修饰牛血SOD,制得PEG- OD仍联物,当其氨基修饰率为30%时,残余活性为80%。杨保珍等用氰尿酰氯活化mPEG-5000后修饰SOD,制得 PEG-SOD,当21%自由氨基被修饰时,酶活性保持82%,家兔体内半衰期为修饰前的7.5倍,免疫原性大为降低,体外对胃蛋白酶或胰蛋白酶的酶解耐受性明显优于天然SOD。洛训懿等采用活化酯法将PEG与重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhGu,Zn-SOD)进行交联修饰,获得Mr约50000的PEG- rhCu,Zn-SOD交联物,对酸、碱和热的耐受力均较未修饰者高,生物半衰期为15h,是天然酶的90倍,酶活性保留80%以上。Ladd等开发出一种新的PEG修饰分子,4-氟-3-硝基苯甲酸PEG,它在428nm处有最大吸光度,摩尔消光系数为 5449L·ml-1·cm-1。他用M(-)r约为2000的这种PEG来修饰SOD,制得的修饰物活性完全得到保留,而用M(-)r约为5000的这种PEG来修饰SOD,则活性为游离SOD的73%。

  7 水蛙素(hirudin)和尿激酶(urokinase,UK)

  水蛙素和UK是一类抗血栓形成的蛋白质药物。水蛭素是从血水蛙的唾液腺中分离到的一个多肽类物质,Mr只有 7000。不同种属的大多数动物在静脉注射给予水娃素时,其血浆半衰期都小于1h,用PEG修饰后其半衰期大增。 Humphries等用家兔做试验,肌注(0.7mg·kg-1)条件下,1 h后可检测到PEG-hirudin的活性,12h达到最大值,注射后 24 h兔血浆中仍能检测到显著的hirudin活性。Esslinger 等对75名健康受试者进行了随机的、有一系列空白对照的Ⅰ期临床试验,研究了大剂量静注、静滴和皮注PEG- hirudin的药效和安全性。结果表明PEG-hirudin不会引起免疫及过敏等不良反应,耐受性良好,而且与未修饰的重组 hirudin相比抗凝作用显著延长。
  PEG也曾用于UK的修饰,虽然效果不是很理想,但体外或体内实验都观察到其血浆半衰期延长,抗原性和免疫原性减弱。Kajihara等用PEG和聚丙二醇(polypropyle glycol, PPG)共聚物来修饰UK制得PEG-PPC-UK。肽图分析显示 PEG-PPG的交联位点主要是A肽键的35,46,61,98,120,135 位的Lys和B肽键的211,300,318,338,348,383和404位的 Lys。两条肽链的平均修饰程度分别为37.8%和19.8%。 PEG-PPG-UK激活纤溶酶原的活性下降,酶动力学研究发现与UK相比,PEG-PPG-UK对纤溶酶原激活的米氏常数Km值增加而Kcat值下降了1/5,而延长家兔静脉注射的血浆半衰期。用PEG-PPG修饰后,UK的自我降解也被完全阻滞。还发现这种交联分子在减轻由血栓引起的肺部不适时比本经修饰的UK更有效。叶建新等用三聚氯氰活化的 mPEG-5000修饰UK的前体——尿激酶原,结果修饰后的分子在家兔体内的半衰期延长了9-13倍,同时酶活性也有损失,溶酰胺活性保持了62%,和修饰UK的情况类似,但溶纤活性仅保持了3.8%-10%,低于修饰UK的情况(残余 30%)。对此,有人采用“可逆修饰”的方法对UK进行修饰,这种修饰酶在体内可以缓慢地分解为UK和修饰剂,故酶活损失相对较小。这种“可逆修饰”也值得PEG修饰借鉴。

  8 血红蛋白(hemoglobin,Hb)

  常规输血存在一些难以克服的困难,如来源紧张,储存期短,可能传播乙肝和AIDS等血原性疾病等。因此有必要研制一种安全有效的血液代用品。以Hb为基础的血液代用品能体内代谢,具有与天然红细胞类似的S形氧解高曲线,是血液代用品研究的主方向。但无基质Hb氧亲和力过高,在循环系统中的存留时间过短。人们用可溶性有机高分子化合物来共轭修饰Hb以期改善它的性质,已尝试过的高聚物材料有右旋糖苷、菊粉、羟乙基淀粉、聚乙烯吡洛烷酮等,用PEG来修饰Hb是近几年来的热点。Ajisaka等制备了 PE-750,PEG-1900,PEG-40000和PEG-5000修饰的Hb。PEG- Hb的P50值在37℃,pH7.4的环境中为10-15mmHg无基质 Hb的P50值为14mmHg,红细胞悬液的P50值为26mmHg),表明PEG-Hb与氧的亲和力仍太高,不过其半衰期却延长了3 倍。为了降低PEG-Hb与氧的亲和力,他们还将磷酸吡哆醛共价交联到Hb分子上,制备出PEG和磷酸吡哆醛共修饰的 Hb(pyridoxylated hemoglobin-PEG conjugate,PHP)。PHP的P50 值在37℃,pH7.4的环境中为20mmHg,表明它与氧的亲和力和PEG-Hb相比有所下降。假设静脉中氧分压为40mmHg,动脉中氧分压为100mmHg,则PHP能释放出所结合氧量的 20%,这个值与红细胞单位重量Hb所运输的氧量基本相同,是无基质Hb的5倍。洪民等比较了四种不同方法活化的PEG衍生物聚乙二醇1,2-环氧丙基醚(EPC-PEG)、聚乙二醇甲酸对硝基苯酚酯(NPC-PEG)、聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(BSS-PEG)和聚乙二醇甲酸甘氨酸流琥珀亚胺酯(SUG- LY-PEG)对猪血红蛋白(pHb)的修饰效率、修饰产物携氧功能及修饰产物的稳定性。EPC-PEG合成方法简便,但合成收率低,修饰能力差,反应时间较长(约4h)。NPC-PEG会成简便,修饰效率高,但修饰后pHb氧亲和力增加较大。BSS-PEG 活化效率高,修饰效率也高,对氧亲和力改变不大,是一种较理想的活化PEG衍生物,只是该分子中存在一个不太稳定的酯键,使得生理条件下PEG-pHb上的PEG链慢慢解离下来。 SUGLY-PEG修饰效率高,对pHb氧亲和力影响不大,也不存在易于断裂的酯键,是四种PEG衍生物中最好的一种,但其合成反应步骤较多,最终收率不高。

  9 干扰素(interferon,IFN)

  IFN是一类能提高机体免疫力,具有抗病毒、抗肿瘤作用的细胞因子。Tang等对rhIFN进行了特异位点的PEG修饰。在天然IFN中Asn25,97是糖基化的,而rhIFN中没有糖基化,不过两者的生物活性是一样的。基于此,可利用定点突变的方法将Asn97替换为Cys,然后对Cys97进行PEG修饰。结果证实这种突变和PEG修饰对IFN-γ活性没有影响。Algra nati等用M(-)r为40000的分枝状PEC分子来修饰IFN-α-2a (PEG-IFN-α-2a),发现其治疗慢性乙型肝炎的功效增强。 Zeuzem等用PEG-IFN-α-2a和IFN-α-2a对531名漫性乙肝患者进行了临床试验及疗效的比较。结果表明:每周一次皮注180mg PEG-IFN-α-2a比每周3次(600万U·次-1)皮注IFN- α-2a更有效。Heathcote等对271名患有慢性乙肝病毒相关的纤维硬化或桥联症的患者进行的试验表明:每周一次皮注 180mg PEG-IFN-α-2a的疗效要显著优于每周三次(300万U· 次-1)皮注IFN-α-2a的疗效。目前,这种PEG修饰的IFN-α-2a 已有生产,如罗氏公司的PEGASY(TM)。姚文兵等用几种不同方法活化的PEG-5000(单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯SC-mPEG,聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯BSC-PEG,单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯SS-mPEG)对IFN-α-2b进行性学修饰。结果表明,SC-mPEG的选择性最高,修饰后产物能保持较好的生物学活性,与未修饰的IFN-α-2b相比,修饰度为10.8%时的残余生物活性为75%,SS-mPEG修饰的IFN-α- 2b在修饰度为13.4%时残余活性为52%。而BSC-PEG可能导致IFN-α-2b分子间交联,在修饰率相近的条件下,其修饰产物生物活性较低,修饰度为19.2%时残余活性为14%。

  10 其 他

  除了以上蛋白质和多肽类药物外,PEG修饰的分子还包括色氨酸酶(Mr=220000)、精氨酸酶(Mr=120000)、精氨酸脱氨酶、嘌啉核苷磷酸化酶、链激酶、纤溶酶原及纤溶酶原激活剂、免疫球蛋白G、葡萄糖脑苷脂酶、神经营养因子、肿瘤坏死因子Ⅰ型受体、卵清蛋白、纤维素酶等。由此可见PEG 修饰应用范围之广。
  综上所述,蛋白质和多肽类药物的聚乙二醇结合物表现出溶解度和稳定性增加,免疫原性、抗原性和毒性减弱或消除,体内药动学性质改善,体内半衰期延长等特性,并增加药物的治疗指数,扩大临床使用等。但也存在某些问题,如药物生物活性的降低,某些偶联物在生理条件下不稳定等。另外还有些潜在问题,如制备过程中某些有毒有机物的使用,蛋白质药物PEG化后体内药动学性质的改变可能产生不良反应等。若能妥善解决这些问题,则蛋白质和多肽类药物的开发和临床应用必将得到长足发展。
  (复旦大学生命科学学院,印春华,张敏) }


 

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