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在生物制品发现中结构质谱学:进展和未来趋势
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2014-4-10          ★★★【字体:

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在生物制品发现中结构质谱学:进展和未来趋势
Structural mass spectrometry in biologics discovery:advances and future trends
Jingjie Mo,Adrienne A. Tymiak and Guodong Chen
Bioanalytical and Discovery Analytical Sciences,Research and Development,Bristol-Myers Squibb Company,P.O. Box 4000,Princeton,NJ 08543,USA
Drug Discovery Today _ Volume 17,Numbers 23–24 _ December 2012
汤教授注:这篇综述扼要和系统介绍了与生物制品结构相关的质谱新进展和未来趋势,值得专业人员和从事生物制品其他方面研究人员一读。
质谱(MS)是蛋白质特征描述关键技术之一。在本文中,提出在生物药品生物制品发现中基于MS结构特征描述,包括一级和较高级结构的特征描述。显示在蛋白质特征描述中MS技术,包括电子转移解离质谱(ETDMS)对一级结构分析和氢/氘交换MS(HDX-MS)为探索蛋白质较高级结构和表位作图。还描述在MS应用中未来趋势评价和生物制品稳定性研究优化备选物分子。
自从约30年前引入重组人类胰岛素作为一种治疗性药物,生物制品(治疗性蛋白质)已成为在疫苗后第二最大生物药物产品类型。与小分子药物比较,生物制品有几种不同优点,包括高特异性,高效,长循环半衰期,较少副作用和较高监管批准率[1]。这些治疗性药物已在许多危及生命疾病治疗中被使用,例如癌症,感染性疾病,炎症和遗传疾病[2–4]。现在制药企业 管道中更致力于生物制品。2011年生物制品市场估计达到约102.4百万美元,从2010年增长约 9.6%[5]。在生物制品药物发现中,有两类蛋白质:靶点蛋白质(在机体内发现)和治疗性蛋白质(药物备选物)。靶点蛋白质正常地以一组分子存在,而治疗性蛋白质特异性地结合至被选择的靶点蛋白质或体内或体外[6]。在药物发现中,目标是发现一种药物备选物有优异生物物理,药代动力学(PK)和药效动力学(PD)性质使通过下游开发机会成功率最大化。从药物发现最早阶段至市场可以得到发展一个新治疗性蛋白质可能需要15年[7]。
MS在生物制品结构性特征描述
通过重组DNA技术产生生物制品一般是复杂,异质性,和受到各种修饰影响。生物制品的生物学疗效,清除率,安全性和免疫原性高度依赖于其结构。因此,对蛋白质结构性特征描述的需要日益增长,尤其是在药物发现期时当正在研究大量备选物时。因为其分析灵敏度,分辨率,选择性和特异性,MS是一种为描述生物制品特征必不可少的基本技术 (图1)[8–10]。主要用于支持宿主表达系统的选择,有最有利品质属性克隆的鉴定,和体外和体内两方面分子稳定性的评价。当耦合在线液相色谱(LC)分离,MS可提供关于蛋白质一级结构的详细信息,例如其分子量(MW),氨基酸(AA)序列,转录后修饰(PTMs),和降解产物。最近, MS的使用已被急剧扩展提供蛋白质较高级结构和动力学的信息。尤其是,现在用氢/氘交换MS (HDX-MS)和离子迁移MS(IMMS)研究蛋白质构形和与其治疗性靶点的相互作用。
分子量和氨基酸序列
描述治疗性蛋白质特征的第一步是测定MW和确证其AA序列。这两个信息对确定产品的同一性和完整性是至关重要。例如,一个备选物生物相似性两个-AA差异间和创新单克隆抗体(mAb) 可通过MW测定检测到和通过AA测序定位[11]。

图1 在药物发现中用质谱生物制品结构性特征描述。通过质谱常规地对一级结构,MW,AA序列和转录后修饰(PTMs)包括糖基化,化学修饰和S–S连接特征描述。为探索生物制品的较高级结构正常使用IMMS和HDX-MS(全局和多肽水平)。表位作图实验可用HDX-MS进行。缩写:AA:氨基酸;HDX-MS:氢/氘交换质谱;IMMS:离子迁移质谱;PTM:转录后修饰;S–S:二硫键。
由于治疗性蛋白质大小大,MW测定需要使用适当离子化技术和一种适宜质量分析器。电喷雾离子化(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)是对蛋白质两种最常用的离子化方法,用ESI 最好当MS与LC连接。飞行时间(TOF)-形质谱分析仪已被广泛接受作为标准仪器为测定大分子的分子量MWs因为其高分辨率(HR)和质量准确性,和宽广m/z检测范围[12]。对一台混合ESI 四极杆-TOF (QTOF)仪器,有MWs的完整mAbs质量准确性约150 kDa可能接近25 ppm[13]或甚至10 ppm[14]。傅里叶变换离子回旋共振质谱法(FT-ICR)质谱仪提供甚至更高质量准确性[15],但是,由于其成本高和维护要求在生物制药实验室中不如TOF-型仪器常见。如用一台质谱仪进行MW测定采用具有适度的分辨能力和质量准确度,一个中上方法,例如有限消化或内链二硫键(S–S)的还原,可使MW分析容易使用因为通常造成碎片小得多和更容易分析。例如,一个完整mAb可被二硫苏糖醇[dithiothreitol, DTT]生成分开的重链和轻链[16]。
可通过两种方法分析蛋白质AA序列:‘自下而上从点到面[bottom-up]’和‘自上而下先总后分的top-down’。前一种方法也被称为多肽作图,蛋白质进行变性,还原,烷化,和消化。然后被消化的多肽用以依赖数据方式LC分离和analyzed by MS和串联MS(MS/MS),据此MS检测 在完全MS模式和MS/MS模式间转换分别收集母离子[precursor ions]和碎片离子质量。由于有限的工作循环[duty cycle],并非在MS模式中检测到的所有离子可被选择在MS/MS模式中进行碎片化。因此,这种实验类型对快速分析或迅速检测洗脱峰并不理想。最近,一种新形式的数据采集,称为MSE,被引入使仪器的工作循环最大化[17]。MSE同时采集在相同模式中对母离子和碎片离子信息通过平行交替采集在或低碰撞能力或高碰撞能量扫描。不需要预先选择MS/MS实验分析物在m/z值。在相同扫描时可检测多个多肽,碎片和分析,确保在色谱图中得到对整个峰的MS和MS/MS数据。母离子(低能MS扫描)变化强度和产物离子(低能MS扫描)变化强度的相关算法鉴定那个母离子与被选定产物离子匹配。用母体和碎片数据可确定每个多肽的序列,而将所有多肽序列放在一起,可确证整个蛋白质序列[18]。
自上而下方法,在气相中通过MS/MS或多阶段MS(MSn)直接对蛋白质测序。与自下而上方法比较方法涉及较少样品处理和提供更可靠分析因可避免在自下而上分析时人为修饰,例如脱酰胺和AA重排[19,20]。但是,当大蛋白质测序时自上而下方法有缺限。用传统碎片方法例如碰撞-诱导解离(CID),对小于5 kDa蛋白质可以实现完全序列覆盖,对较大蛋白质碰撞-诱导解离(CID)碎片化效率受限制[21]。通过应用“非各态经历[nonergodic]”碎片化方法,例如电子捕获解离(ECD),适合“自上而下”测序的蛋白质大小可增至20 Kda[22]。对甚至更大蛋白质,“由中而下”方法或MS/MS 前另加解离,例如‘nozzle-skimmer’碎片化解离和‘预折叠pre-folding’解离,可被用于将大分子破碎至碎片足以小为MS/MS测序[23–25]。 
尽管自上而下方法对直接测定巨大有缺限蛋白质,它们对高通量N-端测序有用途,作为治疗性蛋白质的一个鉴别试验和信号序列处理的完成性质控评估[26,27]。
转录后修饰[PTM]:糖基化,化学修饰和S–S连接 
所有被批准生物制品或当前开发中有转录后修饰(PTMs),可能深度影响与其治疗性应用相关蛋白质性。治疗性蛋白质的修饰对其活性,免疫原性和PDs和治疗性蛋白质关键性质量属性因为这类修饰可能影响产品等效性和免疫原性[29,30]。蛋白质可能显示宽广范围的转录后修饰(PTMs);我们在此探讨在发现阶段经常用基于MS方法连,包括糖基化,“热点”对化学修饰例如氧化,脱酰胺,和异构化,和S–S 连接形式。
糖基化代表最明显和复杂蛋白质转录后修饰(PTMs)形式。它可能显著改变蛋白质构形和因此 除了蛋白质–配体相互作用调节蛋白质的功能活性[31]。糖基化特征地异质性往往存在两种N-和O-连接糖基化的形式与聚糖附着在任何给定部位的微-异质性在一起[32]。糖基化分析涉及到三个方面:完整蛋白质糖基化图形,糖基化位点的局部化,和释放的聚糖结构分析的特征描述。在发现阶段时,糖基化图形的筛选通常是充分出。利用具有高分辨能力和扩展质量范围的质量检测器,糖蛋白质的完整MW分析使主要糖型的分布及其相对丰度被监测。N-连接聚糖比O连接聚糖更有预测性因为它们正常地附着在Asn-X-Ser/Thr的共识序列中Asn残基,其中 X可能是除Pro外的任何氨基酸AA[33],和是主要地岩藻糖化双链复合结构与一个不同数量的末端半乳糖。对有N-和O-连接两者糖基化蛋白质,用多肽-N-糖苷酶F (PNGase F)去除N-连接聚糖可显著地减低分子的异质性和促使质谱解释[32]。
蛋白质的对常见化学修饰‘热点’包括甲基氧化,在Asn-Gly序列Asn脱酰胺,和在Asp-Gly序列天冬氨酸[Asp]异构化。与异构化比较,氧化和脱酰胺用多肽作图分析发鉴定和定量是相对简单,因为氧化和脱酰胺两者引入蛋白质质量变化,典型地对氧化+16 Da和对脱酰胺+1 Da。通过比较修饰和未修饰多肽的MS和MS/MS谱,可观察到相应于特殊修饰质量移动。例如, 一个被氧化多肽前体是较高于相应未氧化多肽16 Da和被氧化多肽的MS/MS碎片含修饰位点也是比非氧化多肽质量较高16 Da。通常可用色谱分离修饰和未修饰多肽,使用或UV或MS信号相对定量修饰。MS定量比UV定量更灵敏,但它可能受修饰和未修饰多肽间离子化效率差别的影响。对修饰和未修饰多肽UV定量只有当没有共洗脱多肽才可靠。
上面描述方法不应用于检测异构化因为异天冬氨酸[iso-Asp]和天冬氨酸[Asp]残基是isobaric(相同质量)。有方法用同位素标记或统计分析来自含天冬氨酸[Asp]-多肽碰撞-诱导解离(CID)碎片化的碎片离子的b:y强都比值和相应的含异天冬氨酸[iso-Asp]-多肽检测异构化,但是,它们要么很费力或并不适用于所有情况下[34,35]。电子捕获解离(ECD)和其类似物电子转移解离质谱(ETD)可被用于区分含天冬氨酸[Asp]多肽与含异天冬氨酸[iso-Asp] 多肽,因为它们在天冬氨酸[Asp]或异天冬氨酸[iso-Asp]部位产生独特的诊断离子,即,对天冬氨酸[Asp]-含多肽侧链丢失(~60 Da)和(c•+58 Da)和对含异天冬氨酸[iso-Asp]-多肽(z – 57 Da)[36,37]。在低分辨率仪器(~60 Da)诊断峰有时可能干扰侧链碎片在Arg和Glu残基残基[38],但是,诊断峰对含异天冬氨酸[iso-Asp]-多肽总是可以明确的规定。 图2显示用一台离子阱仪器一个多肽(VVSVLTVLHQDWLNGK)电子转移解离质谱(ETD)碎片化和其脱酰胺形式。所有z离子,从z3至z15,在电子转移解离质谱(ETD)观察到脱酰胺多肽质谱有质量是高于从未修饰多肽生成的较高1 Da因为它们所有含脱酰胺部位,而只在电子转移解离质谱(ETD)有异天冬氨酸[iso-Asp]残基脱酰胺多肽谱中观察到在m/z 246处诊断性离子(z3 – 57 Da)。
对稳定化蛋白质结构和功能S–S形成是一个至关重要的转录后修饰(PTM)。例如,S–S的错误连接可能导致抗体结构性异构型,增加结构性异质性和潜在地改变抗原结合亲和力[39]。描述S–S连接特征的一个常用战略涉及利用多肽作图一个未-还原消化蛋白质与其相应还原消化蛋白质比较[40]。多肽只在未还原消化出现表明存在S–S连接多肽,而多肽只在还原消化中出现代表其半胱酰[half-cystinyl]多肽组分。S–S连接多肽准确的质量测定提供S–S连接的初始鉴定,而还原多肽的MS和MS/MS分析提供氨基酸AA序列确证。伴随这个方法挑战是样品制备期间可能发生S–S扰乱,大多数可能由于存在存在游离巯基在碱性pH条件下可能诱发巯基-二硫化合物交换 [41]。在酶学消化前游离巯基的烷基化可能缩小S–S扰乱[40]。另外,S–S 连接可以通过从未还原消化通过用基于电子转移解离质谱(ETD)碎片化直接鉴定S–S连接多肽分析,因为电子转移解离质谱(ETD)优先打开S–S和生成解离的半胱酰多肽组分,可被进一步碎片化例如碰撞-诱导解离(CID)(电子转移解离质谱(ETD)/碰撞-诱导解离(CID) MS3)鉴定[42,43]。

图2 一个未修饰的多肽(VVSVLTVLHQDWLNGK) 电子转移解离质谱(ETD)质谱图(顶图)和其脱酰胺产物有或异天冬氨酸[iso-Asp](中图)或天冬氨酸[Asp](底图)残基。与未修饰多肽比较,来自脱酰胺多肽z离子包括脱酰胺位点,亦即,从z3至z15,所有有质量增加1 Da。含异天冬氨酸[iso-Asp]-多肽的电子转移解离质谱(ETD)质谱也有诊断性离子(z3 – 57 Da),从含天冬氨酸[Asp]-多肽区分它。
较高级结构
蛋白质结构和构象动力学的研究对完全了解如何蛋白质驱动和对基本生物学和生化事件贡献的是无价的。不正确折叠的蛋白质经常是对各种降解途径目标和通常容易发生聚集,可能潜在地激发免疫反应[44]。几种基于MS技术是能够描述蛋白质较高级结构特征。例如,ESI-MS 通过显示不同的电荷态分布可区别相同蛋白质不同折叠状态[45],而IMMS,与其根据蛋白质大小,形状,和构形另外分离,曾被应用于解决IgG2抗体S–S的异质性[46]。
更最近,MS与氢氘交换[HDX]结合研究在溶液中蛋白质结构在完整分子水平(全局构形)和多肽水平(局部构形)两个方面[47],包括生物药物可比性研究和评价蛋白质对修饰构像动力学[48,49],与其他技术比较例如X-线晶体学和核磁共振(NMR)谱,氘交换质谱法HDX-MS是更灵敏,涉及更简单样品制备,和可分析更复杂的蛋白质混合物。在HDX-MS中,通过MS监测蛋白质酰胺氢与来自氘缓冲液的氘的交换率。因为HDX率是依赖于蛋白质暴露于溶剂和依赖于分子间/内氢键[inter-/intramolecular hydrogen bonding],从HDX-MS得到的信息可与蛋白质结构相关。随着可商业上得到自动化仪器,不久将来HDXMS将在分析实验室可能被常规使用探索蛋白质较高级结构。用这个技术的主要挑战是HDX测量在多肽水平的数据分析,包括峰归属和计算平均氘摄取,可能被非特异性酶消化和和同位素峰分布移动和/或重叠的复杂化。强壮可靠的和高度重现性色谱分离与HR-MS在一起使用促进这种类型的数据分析[50,51]。
表位作图
表位作图,蛋白质抗原(即表位)和抗体间相互作用特征描述在治疗性抗体发现和发展中至关重要。在有相似表位先导备选物的选择中尤为重要。表位作图涉及某个抗体与其相应的靶点蛋白质结合位点的精细特征表述。方法例如‘金标准’X-线晶体学,突变发生,合成抗原多肽筛选,而曾报道使用有限的蛋白水解或化学交联基于MS方法为表位结合位点作图,但是,这些通常是劳动密集型[52,53]。一项最近研究显示使用OH自由基氧化标记方法为表位作图 [54]。这个方法涉及复杂的数据分析和对动力学研究一般有困难。这个领域正越来越多采用氘交换质谱法[HDXMS],因为涉及来自结合状态抗原–抗体复合物多肽与相同多肽抗原或抗体的游离形式比较HDX(较低HDX率)将显示保护。但是,作为变构构像变化的结果远离结合位点的其他多肽HDX率也可能改变(被结合诱发但不是在结合位点),使数据分析复杂化。用HDX方法的另一个挑战是需要生成常见的蛋白水解多肽(游离抗体和/或抗原和复合物间) 覆盖分子序列的大多数以确保可靠评估结合位点。最近的一项研究使用多个酶(如顺序地使用胃蛋白酶和蛋白酶类型XIII)曾显示实现覆盖超过 90% 序列[55]。在该研究中,两个复合物表位结合位点用氘交换质谱法[HDX-MS]鉴定结合位点的发现与用突变发生,分子学模型分析,电子显微镜和合成抗原多肽筛选鉴定一致。结合涉及的多肽与涉及变构构象变化多肽(保护较低)比较也表现出在氢氘交换[HDX]率(更受保护)更显著变化[55]。电子捕获解离(ECD)/电子转移解离质谱(ETD)的最近掺入至氘交换质谱法[HDX-MS]对碎标记的多肽使在单个氨基酸AA残基水平测定氢氘交换[HDX]率[56,57]因为电子捕获解离(ECD)/电子转移解离质谱(ETD)具有低程度的多肽酰胺氢分子内迁移。
MS在生物制品稳定性研究 
药物发现期间,需要评估蛋白质药物备选物对降解和修饰体外(在生产和贮存期间)和体内(在患者给药中)的易感性以便从生物物理性质的角度完全评价备选物分子的可开发性。图3概括了在生物制品药物发现中对备选物分子各种稳定性研究。基于MS方法常用于对备选物分子在加压条件下描述降解产物和/或碎片和化学修饰的特征表征。. 
体外稳定性
生物制品在液体制剂中的主要降解途径之一是碎片化。条件例如温度升高,暴露至化学品,光,或这些的组合下,蛋白质碎片化常发生在C-端侧的酸性残基,或接近某个丝氨酸[Ser]残基,和主要裂解位点在天冬氨酸[Asp]和脯氨酸[Pro]间[58]。产生的碎片通常可用紫外-高效液相色谱(UHPLC)分离解决和通过准确质量测定指定碎片化位点。从或UV色谱峰丰度或MS峰丰度可计算碎片化和/或降解产物的相对丰度。
除了碎片化,生物制品也对修饰敏感,可通过多肽作图评估。从修饰和未修饰多肽或UV或MS信号计算修饰的程度,包括对氧化,脱酰胺和异构化‘热点’。图4显示一个通过提取离子色谱图(EIC)在多肽(FNWYVDGVEVHNAK)异构化相对定量的实例。通过匹配计算多肽质量提取MS信号得到两个峰,一个有天冬氨酸[Asp]残基和其他有异天冬氨酸[iso-Asp]残基,通过电子转移解离质谱(ETD)-MS实现其区别。通过这些两峰面积积分可计算异构化的相对丰度。

图3 生物制品药物发现工作流程中对生物制品稳定性研究。开始纯化蛋白质,评价其热稳定性和通过加速稳定性研究进行初始制剂筛选,冰冻和/或冻融研究和物理稳定性研究。此外,还评价蛋白质溶解度和血清稳定性。缩写:PBS:磷酸缓冲液盐水。

图4 通过提取离子色谱异构化作用的相对定量。根据单一同位素峰m/z值提取质谱信号。为计算异构化百分率积分峰面积。
体内稳定性
除了在生产和贮存期间发生降解和/或修饰,在给予患者后也可能发生生物制品的体内生物转化(即蛋白水解,化学修饰)。例如,曾观察到体内人类抗体在Fc区域的脱酰胺作为生理条件下自然过程[59]。在体内修饰可影响药物疗效的情况中,需要从PK数据和体内降解动力学两方面预测药物的生物利用度和血清半衰期。体内稳定性数据提供生物制品在意向治疗环境生物物理性质的重要信息。
生物制品的体内稳定性蛋白质被提取和从机体纯化后可利用描述体外稳定性相似的基于MS方法用于特征描述。因为基于MS技术的灵敏度和特异性通常是受蛋白质低丰度的限制和生物基质成分的抑制作用。对体内分析一种有效方法是MS分析前用免疫亲和捕获对感兴趣的蛋白质纯化和富集减低样品的复杂性。如今,对宽广范围生物制品可得到的高特异性抗体,免疫亲和捕获正在成为从生物学基质中回收蛋白质实际方法和是适合于基于MS-分析下游。
进行免疫亲和捕获最常用方法之一是用抗体包被的磁珠作为亲和探针[60,61]. 例如,通过用蛋白质G免疫固化磁珠,一种特异性抗体通过与蛋白质G相互作用可被耦合至珠,而然后通过抗原-抗体相互作用抗原可被抗体特异性地捕获。洗掉所有其他非结合组分和蛋白质可被洗脱为进一步MS分析。 
免疫亲和层析,替代磁珠用一个免疫亲和柱[62],也可被用于捕获感兴趣的蛋白质。通过装填特异性抗体包被的树脂柱,感兴趣蛋白质可被选择性地捕获。一个缩小版的免疫亲和柱是含被激活的共价结合抗体基于二氧化硅的树脂移液器吸头[63]。与自动化工作站在一起被装备多个通道,可能实现高通量样品制备。
结束语
在生物制品发现中MS是最高度利用的分析技术之一。除了较高级结构,利用基于质谱技术也可描述蛋白质包括MW,氨基酸AA序列,S–S连接,糖基化图形,和许多其他转录后修饰(PTMs)结构特征。在MS仪器技术的不断发展将提供更高灵敏度,分辨率,和质谱准确性的更新能力,进一步改善MS在蛋白质特征描述的性能。在生物制品研究中将继续涉及电子转移解离质谱(ETD)-MS和氘交换质谱法[HDX-MS]的使用与应用增加。MS在生物制品稳定性研究的独特作用与增强生物物理性质将体外和体内研究期间在优化和选择蛋白质的过程中将进一步扩展提供备选物分子全面特征的描述。
参考文献
1 Leader, B. et al. (2008) Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21–39
2 Chan, A.C. and Carter, P.J. (2010) Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 10, 301–316
3 Weiner, L.M. et al. (2010) Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 10, 317–327
4 Clienti, S. et al. (2011) Monoclonal antibodies for the treatment of severe asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 11, 253–260
5 Maheshwari, S. (2011) Global protein therapeutics market: beefing up towards futuristic growth, www.pharmaphorum.com, online report, October 11, 2011.
6 Jackel, C. et al. (2008) Protein design by directed evolution. Annu. Rev. Biophys. 37, 153–173
7 Reichert, J.M. and Paquette, C. (2003) Therapeutic recombinant proteins: trends in US approvals 1982 to 2002. Curr. Opin. Mol. Ther. 5, 139–147
8 Chen, G. et al. (2011) Characterization of protein therapeutics by mass spectrometry recent developments and future directions. Drug Discov. Today 16, 58–64
9 Gross, M.L. et al. (2011) Protein and Peptide Mass Spectrometry in Drug Discovery. Wiley 
10 Kaltashov, I.A. et al. (2012) Advances and challenges in analytical characterization of biotechnology products: mass spectrometry-based approaches to study properties and behavior of protein therapeutics. Biotechnol. Adv. 30, 210–222
11 Xie, H. et al. (2010) Rapid comparison of a candidate biosimilar to an innovator monoclonal antibody with advanced liquid chromatography and mass spectrometry technologies. MAbs 2
12 Zhang, Z. et al. (2009) Mass spectrometry for structural characterization of therapeutic antibodies. Mass Spectrom. Rev. 28, 147–176
13 Brady, L.J. et al. (2008) Molecular mass analysis of antibodies by on-line SEC-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 502–509
14 Gadgil, H.S. et al. (2006) Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 867–872
15 Valeja, S.G. et al. (2011) Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 8391–8395
16 Chelius, D. et al. (2010) Structural and functional characterization of the trifunctional antibody catumaxomab. MAbs 2, 309–319
17 Plumb, R.S. et al. (2006) UPLC/MS(E); a new approach for generating molecular fragment information for biomarker structure elucidation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 1989–1994
18 Doneanu, C. et al. (2012) Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry. MAbs 4, 24–44
19 Gaza-Bulseco, G. et al. (2008) Method to differentiate asn deamidation that occurred prior to and during sample preparation of a monoclonal antibody. Anal. Chem. 80, 9491–9498
20 Fodor, S. and Zhang, Z. (2006) Rearrangement of terminal amino acid residues in peptides by protease-catalysed intramolecular transpeptidation. Anal. Biochem. 356, 282–290
21 Kelleher, N.L. (2004) Top-down proteomics. Anal. Chem. 76, 197A–203A 
22 Breuker, K. et al. (2008) Top-down identification and characterization of biomolecules by mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 1045–1053
23 Pipes, G.D. et al. (2010) Middle-down fragmentation for the identification and quantitation of site-specific methionine oxidation in an IgG1 molecule. J. Pharm. Sci. 99, 4469–4476
24 Zhai, H. et al. (2005) Consecutive ion activation for top down mass spectrometry: improved protein sequencing by nozzle-skimmer dissociation. Anal. Chem. 77, 5777–5784
25 Han, X. et al. (2006) Extending top-down mass spectrometry to proteins with masses greater than 200 kilodaltons. Science 314, 109–112
26 Ren, D. et al. (2009) Top-down N-terminal sequencing of immunoglobulin subunits with electrospray ionization time of flight mass spectrometry. Anal. Biochem. 384, 42–48
27 Zhang, Z. and Shah, B. (2007) Characterization of variable regions of monoclonal antibodies by top-down mass spectrometry. Anal. Chem. 79, 5723–5729
28 Jenkins, N. et al. (2008) Post-translational modifications of recombinant proteins: significance for biopharmaceuticals. Mol. Biotechnol. 39, 113–118
29 Schellekens, H. (2004) Biosimilar therapeutic agents: issues with bioequivalence and immunogenicity. Eur. J. Clin. Invest. 34, 797–799
30 Wenzel, R. et al. (2007) Comparing two botulinum toxin type A formulations using manufacturers’ product summaries. J. Clin. Pharm. Ther. 32, 387–402 
31 Sola, R.J. and Griebenow, K. (2010) Glycosylation of therapeutic proteins: an effective strategy to optimize efficacy. BioDrugs 24, 9–21
32 Marino, K. et al. (2010) A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713–723
33 Vance, B.A. et al. (1997) Multiple dimeric forms of human CD69 result from differential addition of N-glycans to typical (Asn-X-Ser/Thr) and atypical (Asn-Xcys) glycosylation motifs. J. Biol. Chem. 272, 23117–23122
34 Terashima, I. et al. (2007) Identification of deamidation and isomerization sites on pharmaceutical recombinant antibody using H(2)(18)O. Anal. Biochem. 368, 49–60
35 Lehmann, W.D. et al. (2000) Analysis of isoaspartate in peptides by electrospray tandem mass spectrometry. Protein Sci. 9, 2260–2268
36 Cournoyer, J.J. et al. (2007) Quantitating the relative abundance of isoaspartyl residues in deamidated proteins by electron capture dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 48–56
37 Chan, W.Y. et al. (2010) Electron transfer dissociation with supplemental activation to differentiate aspartic and isoaspartic residues in doubly charged peptide cations. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 1012–1015
38 O’Connor, P.B. et al. (2006) Differentiation of aspartic and isoaspartic acids using electron transfer dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 15–19
39 Dillon, T.M. et al. (2008) Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J. Biol. Chem. 283, 16206–16215
40 Wypych, J. et al. (2008) Human IgG2 antibodies display disulfide-mediated structural isoforms. J. Biol. Chem. 283, 16194–16205
41 Liu, H. et al. (2007) Characterization of lower molecular weight artifact bands of recombinant monoclonal IgG1 antibodies on non-reducing SDS-PAGE. Biotechnol. Lett. 29, 1611–1622
42 Wu, S.L. et al. (2010) Identification of the unpaired cysteine status and complete mapping of the 17 disulfides of recombinant tissue plasminogen activator using LC–MS with electron transfer dissociation/collision induced dissociation. Anal. Chem. 82, 5296–5303
43 Wang, Y. et al. (2011) Characterization and comparison of disulfide linkages and scrambling patterns in therapeutic monoclonal antibodies: using LC–MS with electron transfer dissociation. Anal. Chem. 83, 3133–3140
44 Maas, C. et al. (2007) A role for protein misfolding in immunogenicity of biopharmaceuticals. J. Biol. Chem. 282, 2229–2236
45 Kaltashov, I.A. et al. (2010) Conformation and dynamics of biopharmaceuticals: transition of mass spectrometry-based tools from academe to industry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 323–337
46 Bagal, D. et al. (2010) Resolving disulfide structural isoforms of IgG2 monoclonal antibodies by ion mobility mass spectrometry. Anal. Chem. 82, 6751–6755 47 Engen, J.R. (2009) Analysis of protein conformation and dynamics by hydrogen/deuterium exchange MS. Anal. Chem. 81, 7870–7875
48 Houde, D. et al. (2011) The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100, 2071–2086
49 Wei, H. et al. (2012) Using hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry to study conformational changes in granulocyte colony stimulating factor upon PEGylation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 498–504
50 Wales, T.E. et al. (2008) High-speed and high-resolution UPLC separation at zero degrees Celsius. Anal. Chem. 80, 6815–6820
51 Kazazic, S. et al. (2010) Automated data reduction for hydrogen/deuterium exchange experiments, enabled by high-resolution Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 550–558
52 Dhungana, S. et al. (2009) Epitope mapping by proteolysis of antigen–antibody complexes. Methods Mol. Biol. 524, 87–101
53 Umanah, G.K. et al. (2010) Identification of residue-to-residue contact between a peptide ligand and its G protein-coupled receptor using periodate-mediated dihydroxyphenylalanine cross-linking and mass spectrometry. J. Biol. Chem. 285, 39425–39436
54 Jones, L.M. et al. (2011) Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Anal. Chem. 83, 7657–7661
55 Zhang, Q. et al. (2011) Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129–7136
56 Rand, K.D. et al. (2009) Protein hydrogen exchange measured at single-residue resolution by electron transfer dissociation mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 5577–5584
57 Rand, K.D. et al. (2011) ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 1784–1793
58 Manning, M.C. et al. (1989) Stability of protein pharmaceuticals. Pharm. Res. 6, 903–918
59 Liu, Y.D. et al. (2009) Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals 37, 313–322
60 Schneider, N. et al. (2010) Analysis of lysozyme in cheese by immunocapture mass spectrometry. J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 878, 201–206
61 Pocsfalvi, G. and Schlosser, G. (2011) Detection of bacterial protein toxins by solid phase magnetic immunocapture and mass spectrometry. Methods Mol. Biol. 739, 3–12
62 Wang, Y. et al. (2011) Selective sample cleanup by immunoaffinity chromatography for determination of fenvalerate in vegetables. J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 879, 3531–3537
63 Hall, M.P. et al. (2010) Ligand-binding mass spectrometry to study biotransformation of fusion protein drugs and guide immunoassay development: strategic approach and application to peptibodies targeting the thrombopoietin receptor. AAPS J. 12, 576–585

 


 

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