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多肽蛋白质制剂研究的热点和难点
作者:多肽药动…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-6-3          ★★★【字体:

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蛋白质多肽制剂研究的难点与热点

多肽蛋白药物制剂研究的几个热点

生物技术的发展,极大地促进了多肽蛋白类药物的研究与开发,使之成为医药研究领域的一个重要方面,并代表着医药产品发展的方向。由于这一大类药物的特性,在应用上还存在很多问题,所以近年来多肽蛋白的研究倍受关注。研究的热点主要集中在药物动力学、结构修饰、口服给药和纳米载体等几个方面。本文结合有关文献,对这几个方面加以简单总结,以供参考。

1 药物动力学

与天然或合成的小分子药物相比,由氨基酸组成的多肽蛋白类药物具有相对分子质量大、不易透过生物膜、易在体内酶解、降解代谢途径多样等特点,因而在生物体内的药物动力学机制有其特殊性和复杂性。另外给药方案、给药系统、蛋白结合等因素都会对其药动学产生影响。

 
多肽蛋白类药物口服具有十分明显的首过效应,在到达体循环前大量降解而被清除。如胰岛素首次通过肝脏时已有40%~50%被清除,采用适当的载体、采用吸收促进剂和酶抑制剂等可以增加非注射途径给药的生物利用度。另外研究显示,给药途径的不同对药物的体内分布、生物利用度和药理作用具有显著的影响。如不同组织的毛细管黏膜在渗透性上差异很大。鼻黏膜对相对分子质量低于1000的多肽有较高渗透性,小肠对该范围内的多肽渗透性较低,直肠类似于鼻黏膜。

由于多肽蛋白药物多为亲水性强而亲脂性差,并与血浆或组织蛋白结合率高等原因,其分布容积一般很小,多为0.04~0.2L·kg-1,而小分子药物多为1~20L·kg-1。并且多肽蛋白药物在体内一般呈非线性药动力学特征。

 
多肽蛋白类药物在体内通常与相应受体结合而起效乃至代谢,因而受体在组织器官中的分布往往对药物在体内的分布及效应具有重要影响。


大多数多肽蛋白类药物无法进入中枢神经系统(CNS),可以通过改造结构以提高半衰期,增加脂溶性以改善血脑屏障(BBB)的被动渗透,降低CNS对药物的外排作用等提高BBB对多肽蛋白类药物的摄取。

体内存在的多肽蛋白酶可使相应的蛋白质和多肽迅速失活,这是多肽蛋白类药物的主要代谢途径。这类酶广泛存在,既有不同的分布特征,又有细胞组织的特异性。胃肠道腔管内分布着大量特异酶,结肠、回肠中相对较少。其中,小肠中的细胞色素P450CYP3A4对口服多肽蛋白类药物的代谢起主要作用。链长小于8个氨基酸的小肽在肝中有较高的萃取率。有些经肝消除的药物可分泌入胆管。具有代表性的肝酶有组织蛋白酶、溶酶体和蛋白酶,在胆小管膜中还发现了一些膜结合的氨肽酶。肾中的底物、生长因子、酸碱平衡以及肾功能的变化都会引起多肽蛋白代谢的变化。多肽蛋白类药物在血液中通常不太稳定。现已知分布在血液中的酶有二肽酶Ⅳ(DAPⅣ)、后脯氨酸断裂酶(PPCE)和氨肽酶。此外,一些对多肽蛋白酶稳定的多肽蛋白类药物也可能在体内的解毒系统中被代谢。如环孢素至少可被代谢为9个代谢物,其生化转运包括在环孢素各个部位的羟基化、脱甲基作用及细胞色素450系统作用。实验证实,抑制细胞色素P450系统可提高环孢素的血液水平。由于以上原因,多肽蛋白的体内消除半衰期一般很短(小于1h),但经适当结构改造也可以使消除半衰期大大延长。肾脏在多肽蛋白类药物代谢中起重要作用。肾小球可滤过相对分子质量小于3×104的蛋白,如干扰素、白介素-2等。肾小球滤过这一消除机制的能力有一上限,若只靠滤过,多肽蛋白类药物至少有40min的半衰期,但大多数的半衰期要小得多,说明体内有其他更有效的消除机制。较大的多肽常通过受体介导或形成无活性物质来清除,受体介导清除可能是一主要的清除机制,如胰岛素,若减少与受体的亲和力,就会显著提高其血浆半衰期,且胰岛素受体的抗体又可延长其半衰期。

在进行多肽蛋白类药物的药代动力学研究中,发现有些药物药代动力学参数具有明显的种属差异,如促甲状腺激素释放激素在家兔和人体内的半衰期分别是2和0.67h,相差约3倍,而在豚鼠和猪体内则相差近40倍。因此在进行药代动力学研究中应注意选择合适的动物。


 2 结构修饰

 
化学修饰可改变蛋白质和多肽分子的性质,如消除免疫原性和免疫反应性,延长在体内的作用时间,提高药效等,因而在很大程度上扩展了蛋白质和多肽的应用范围。

 
蛋白质的化学修饰主要包括蛋白质分子侧链基团的改变和蛋白质分子中主链结构的改变两个方面,其中前者研究较多。化学修饰剂的性能是修饰反应效果好坏的关键。目前用作蛋白质的修饰剂主要有右旋糖苷、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多聚唾液酸、PEG等,其中以PEG类修饰剂量最为常用。


PEG类修饰剂与其他修饰剂相比,毒性小、无抗原性、具有良好的溶解性、且该聚合物具有得到美国FDA认证的生物相容性。PEG还可将其优良性质传递到修饰后的蛋白质和多肽等生物分子上,以改变它们的生物分配行为和溶解行为。另外一个重要因素是修饰反应条件的选择。修饰反应过程中,反应温度、pH、反应介质和反应物配比等都要控制在一定的范围内。


Tsutsumi等制备出了54%的氨基发生PEG化的中等分子量的PEG-IL-6。与天然IL-6比较,其血浆半衰期是天然IL-6的100倍,其体外生物活性保留了51%,而其体内促血小板生成的作用比天然IL-6高出500倍,且不会引起IgG合成的增加。


洪民等制备了PEG750,PEG1900,PEG4000和PEG5000修饰的Hb。PEG-Hb的P50值在37℃ pH7.4的环境中为10~15mmHg(无基质 Hb的P50值为14mmHg,红细胞悬液的P50值为26mmHg),虽然PEG-Hb与氧的亲和力仍高,但其半衰期却延长了3倍。为了降低PEG-Hb与氧的亲和力,他们还将磷酸吡哆醛共价交联到Hb分子上,制备出PEG和磷酸吡哆醛共修饰的Hb,修饰物的P50在37℃ pH7.4的环境中为20mmHg。


Olaf等以PEG修饰了重组人粒性白细胞集落刺激因子和重组人巨核细胞生长形成因子。两者未修饰前在体内的循环时间都非常短,后者直接应用基本无效。在PEG化后,前者的血中滞留时间明显延长,后者注射后可产生明显的血小板反应,并可纠正小鼠在放化疗后的血小板严重减少。


目前,化学修饰仍然存在修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高,修饰的药物分子分子量分布宽、活性降低、稳定性有时不够理想等突出问题。


3 口服给药

蛋白和多肽药物口服基本无效,常用的给药方式是注射给药。但近年来的研究证明,采用适当载体和其他方法,可以使多肽蛋白药物口服产生一定的效果,并有若干种制剂已经通过或正在进行临床验证。由于口服给药是最方便的给药方式,所以这一方面的研究倍受世人关注。


多肽蛋白药物的口服给药须要克服两个屏障,即胃肠酶屏障和黏膜物理屏障。胃肠道酶的降解作用是多肽蛋白药物口服生物利用度低的重要原因。胃肠道中存在着胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶A及酯酶等多种酶,肽类、蛋白质类药物在胃肠道环境里,其生物活性大部分丧失或全部丧失。克服酶屏障则可采用酶抑制剂,对药物结构进行改造和采用新型药物载体。多肽蛋白的结构修饰已如前述,不再重复。蛋白质和肽类药物与其代谢酶的抑制剂一起使用能降低或抑制代谢酶的活性,减少这些酶对药物的作用,从而提高生物利用度。使用吸收促进剂来提高生物膜通透性是目前研究中采用的克服物理屏障的主要方法,但可引起黏膜损伤,因此研究已经不多。文献报道的促进剂包括水杨酸类、胆酸盐类、表面活性剂、脂肪酸类、氨基酸类衍生物、金属螯合剂等。


口服给药最重要的途径是新型给药系统的研究,包括肠溶包衣制剂(如胶囊和微丸)、微乳、脂质体、微粒和纳米粒。微乳的特点是制备工艺简单,主要成分有脂溶相——中、长链脂肪酸甘油酯、水相、药物,再加非离子型表面活性剂,如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯等。目前微乳、复乳制剂在包封率与稳定性方面还有待于改进。口服脂质体的局限性在于药物用量大,包封率较低,稳定性不佳等,这些因素影响了口服脂质体制剂的临床应用。因此,多肽蛋白药物口服载体的研究主要集中在微粒/微囊和纳米粒/纳米囊上,尤其是后者。


4 纳米粒

纳米粒大小在10~1000mm范围内,分散在水中可形成近似胶体溶液。纳米粒作为多肽蛋白给药系统已经显示出其优越性,其优点表现在以下方面:对药物的保护作用;可以跨越黏膜屏障;可以改变药物在体内的分布;制备材料、方法灵活多样。制备纳米粒的载体材料可分为生物降解型和非生物降解型两种。生物降解型包括:聚α-羟基酸类,如聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物和聚羟基丁酸等;交链聚酯,如聚丙交酯、聚ε-已内酯及聚氰烷基丙烯酸烷基酯等;聚原酸酯;聚酐和多肽等,非生物降解型包括:聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚酰胺等,以生物降解型较为多用。


近来也有用非聚合物材料如类脂制备纳米粒。如Fuentes以1mg胰岛素溶于100ulNaOH为内水相,以三棕榈酸甘油酯和卵磷脂为油相超声制备W/O乳剂,向此乳剂中加入外水相2%泊洛沙姆制备W/O/W复乳。以1%泊洛沙姆溶液稀释后,在搅拌下蒸发溶液6h。粒径因乳化剂的用量与种类不同而不同,多在200nm左右。将这种纳米粒以聚乙二醇一硬脂酸酯包被后可以大大增加在胃肠道的稳定性。

另外为了改善纳米粒的性质,增加对药物的保护作用,增强靶向或黏膜黏附能力,改变纳米粒在体内的分布等,对纳米粒的表面修饰进行了较多的研究。例如胃及十二指肠前段的黏膜黏液中的粘蛋白的寡糖侧链主要由N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、岩澡糖、半乳糖、唾液酸等5种糖基组成,可与外源凝集素如番茄凝集素、支原菌属凝集素、天门冬属凝集素发生特异结合。利用这一特异性,以外源凝集素修饰纳米粒后用于口服给药,可以实现膜黏附,从而延长其在胃肠道壁或胃肠道的特定吸收部位的接触和转运时间,促进纳米粒药物的胃肠道吸收。


用聚合物包裹纳米粒,改变纳米粒的表面性质如亲水性、表面电荷,pH稳定性等,可以增加对纳米粒的稳定性和对药物的保护左右,增加黏膜粘附性能,提高在循环系统的滞留时间,改善药物的包封率等。常用的物质有聚乙二醇、聚痒乙烯、非离子表面活性剂、壳聚糖等。

Kim等考察了吲哚美辛聚乳酸纳米粒,PEG包衣能明显地降低其细胞毒性。PEG包衣也可改变纳米粒在体内各组织的分布。Awashima等制备了由具有黏膜粘性聚合物如壳聚糖、聚丙烯酸及藻酸钠包衣的载有依降钙素的纳米粒,给禁食Wistar大鼠灌胃,发现同未包衣的纳米粒及依降钙素溶液相比,壳聚糖包衣的依降钙素的纳米粒能显著降低血钙水平,持续时间长达48h,即使大鼠未禁食,其黏膜粘附作用也未改变,降低血钙水平的效果仍然令人满意。


5 结语


多肽蛋白药物多为生物活性物质,具有微量高效的作用,在人体各个系统发挥着各种重要功能。1902年,伦敦大学医学院的Bayliss和Starling从动物的胃肠发现一种能引起胰腺分泌活动的物质,称为促胰液素,这是人类第一次发现活性多肽物质。伴随着分子生物学、生物化学技术的发展,目前人们已经发现的生物活性多肽达数万种,其中绝大多数的功能尚待研究,而制成药物制剂用于临床更是一项极为艰巨的工作。但是可以相信,随着研究的深入和技术的进步,多肽蛋白药物必然成为医药发展的一个重要方面,成为人类战胜疾病,维护健康的强有力手段。

 


 

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