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流动相的选择技巧
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-1-7          ★★★【字体:

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流动相的选择技巧

常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈,甲醇有其性价比的优势,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高,毒性比甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈,甲醇有其性价比的优势,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高,毒性比甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统压力要比甲醇低很多,且截止波长比甲醇低20nm,增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性,所以我们一般倾向于多用乙腈,少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好,更换溶剂试试是一个很好的选择,毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。

 

  对流动相的优化主要在水相上下功夫,水里可以加酸、加碱、加盐,从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少,主要还是加酸,常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等,其中最常用的是磷酸和三氟乙酸,磷酸在低波长下没有紫外吸收,而三氟乙酸在低波长下有,但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行,所以单纯做液相,低波长下磷酸最合适,三氟乙酸有吸收,运行梯度时基线漂移很严重,而做液质就要考虑首选三氟乙酸了,近些年还比较流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别,我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值,从而改善样品的分离度和峰形。

 

  相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好,从图中可以看出多数样品在低pH值下峰形都比中性要好,这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。色谱柱主要都是硅胶基质,现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除,硅羟基会造成样品峰拖尾,一般认为硅羟基的pKa在3.5到4.5之间,低pH值能帮助抑制硅羟基的活性,减小拖尾,从而改善峰形,提高分离度。水溶液中添加0.1%(体积)的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右,用作流动相正好抑制硅羟基的活性,所以开发液相分析方法时流动相首选水加01.%的磷酸,然后再以此为基础做优化。

 

  在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐,缓冲盐的选择原则是:简单、稳定、缓冲能力强、配制简单,需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐,主要是钾盐和钠盐,再有就是醋酸盐,常用的盐浓度在10~20mM左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题,往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾,但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响,现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时会需要调节pH值到碱性,具体pH要视色谱柱的耐受范围而定,常用 NaOH、KOH溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH的试剂,也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。

 

  在缓冲盐做流动相时,出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时,可以考虑使用离子对试剂,常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐,但是流动相里使用离子对试剂时,系统需要的平衡时间长,样品保留时间不是很稳定,因为离子对试剂的背景吸收基线会很差,且做完样品后需要长时间清洗,所以我们尽量不使用离子对试剂。

 

  使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题,尤其是在流动相里添加醋酸铵以后,在低波长下梯度变化时基线下降非常严重,严重影响对含量较小杂质的准确定量,可以考虑在乙腈里加入10%的水,水中预先加入10倍水溶液浓度的缓冲盐,这样梯度中A、B两项盐的浓度相同,可以避免基线漂移严重的问题。

 

  原料药一般结构式比较大,分子构成比较复杂,开发分析方法时用水加磷酸效果可能效果不好,通常还要求最少尝试2和6.5两个pH值的磷酸盐缓冲溶液,并依据结果对流动相进行pH优化,如效果不理想再进一步尝试其它缓冲盐溶液。开发中间体或者IPC的分析方法时可以根据经验酌情简化流动相的选择过程。


 

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