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不同缓冲液流动相配制方法对分析结果有什么影响?
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-1-7          ★★★【字体:

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不同缓冲液流动相配制方法对分析结果有什么影响?


答:HPLC的流动相主要用水性溶剂(水以及缓冲液)、有机溶剂、或它们的混合液。但不同资料上对缓冲液的表示方法不一,因此往往会对缓冲液有不同的解释,使得资料上表示的内容与实际配置的方法不同,而产生流动相的差异,影响色谱图和分析结果。而且,不仅是缓冲液,有时还要考虑到溶剂的混合方法等流动相配制方法等因素。下面以具体的事例,说明流动相配制方法对分析结果的影响。


(1)缓冲液的配制
“20mM磷酸缓冲液(pH2.5)”如何配制,由于表述的不清楚,有许多种可能的配法,就是以钠离子而言,“20mM”也不清楚是磷酸还是磷酸钠的浓度。若认为是“20mM”磷酸(钠)缓冲液,“20mM”可看作是磷酸的浓度。另一方面,若把“20mM”看作是钠的浓度,也可以认为是“20mM磷酸二氢钠水溶液调节pH后的缓冲液(而且,20mM磷酸钠水溶液的pH在5.0附近,只要稍用一点酸就可调到pH 2.5)。这时,由于调节pH用的酸,产生离子对的效果,会对分析结果有影响。

这三种不同的解释,在实际中对分析结果有很大的影响,见图3.6所示。A是“20mM”作为磷酸浓度解释,将作为“20mM磷酸(钠)缓冲液(pH2.5)”调节的溶液用于流动相的结果。B和C“20mM”作为磷酸二氢钠的浓度解释,分别加磷酸和高氯酸调节pH为2.5时的结果。可见,不同的缓冲液配制方法对二氢可待因的保留时间有明显的影响,这给分析造成一定的困难。因此,对缓冲液应尽量明确溶液的特性和配制方法(尤其pH的调节),以免产生不同的解释。


(2)有机溶剂和水性溶剂的混合方法
有机溶剂和水性溶剂的混合液是经常作为流动相用的,但由于混合方法的不同,有时分析结果相差很大。如上例中,采用20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH 2.5)与乙腈的混合液时,若混合比为9:1,即20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH 2.5)与乙腈的体积比为9:1,也就是可以解释为各自按体积比量取后进行混合。另外,也可以理解为20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH 2.5)中含有10%的乙腈。按两种理解方式配制的流动相会对分析结果(特别是保留时间)有显著的影响,这点必须注意。


在一般的情况下, 配制HPLC用流动相时,用A液:B液=3:2(V:V)的表示方法,即A液体积比相当于3,B液体积比相当于2,分别量取混合(实际上混合后的溶液体积要小于5)。


(3)流动相缓冲液pH的调节
流动相A:20 mM磷酸(钠)缓冲液(pH2.5)90%与乙腈10%混合,流动相B:20 mM磷酸(钠)缓冲液90%与10%乙腈混合,pH2.5。前者缓冲液的pH为2.5,但混合后pH会发生变化,后者含有机相混合液的pH为2.5,两者有明显的区别,分析结果也会不同。


在一般情况下,pH值仅指缓冲液的pH,不含有机相。总之,不仅是流动相的配制方法,试样溶液和其他溶液的配制也经常有上述问题。另外,在不同部门(医药部门或化工部门)各自都有自己的常识和习惯,在这种情况下,参考相关的标准和规范,以避免混乱。


 

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