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葡聚糖凝胶层析与葡聚糖凝胶柱的使用方法:
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-1-7          ★★★【字体:

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葡聚糖凝胶柱的使用方法:
(1)
预处理
称取Sephadex G-2550100目)约5g,加入蒸馏水100ml,置室温下3h进行溶胀。
(2)
装柱
凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好,先加入1/3柱体积蒸馏水,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入,使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹。否则,必须到出重装,装好后,用蒸馏水平衡23h即可加样品分离。

(3)
加样

加样前,首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出,直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)为止。然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要让溶液把凝胶冲松浮起,加完样品后,打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐,再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器23次,待全部进入层析柱后,即可进行洗脱。
(4)
洗脱与收集
洗脱时,用蒸馏水作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.81.0ml/min。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集,每管收集3ml,共收集10管。据经验,45号管核苷酸浓度最大,可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异,管号会有变化,必要时可用紫外检测A260nm,找出浓度最大的管号。
(5)
凝胶的再生和回收
凝胶柱使用一次后,必须反冲疏松一次,平衡后再使用。若使用数次,就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡,然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕,将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干,再用95%乙醇洗两次,在60烘箱中烘干,回收保存。

 

实验五.  葡聚糖凝胶层析

 

【实验目的】

1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】

凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术,这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒,目前应用较广的是:具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)。

    葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1,2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制,交联度越大,网孔结构越紧密;交联度越小,网孔结构就越疏松,网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

    葡聚糖凝胶层析,是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱,各个组分由于分子量不相同,在凝胶柱上受到的阻滞作用不同,而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻,不能进入凝胶颗粒内部,阻滞作用小,随着溶剂在凝胶颗粒之间流动,因此流程短,而先流出层析柱;分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内,阻滞作用大,流程延长,而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间,则在两者之间从柱中流出,由此就可以达到分离目的。

    本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体,来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106, 而溴酚蓝分子量为670,二者分子量相差较大,前者完全排阻,而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内,二者通过层析柱的时间不同而分开。

【实验材料】

1.实验器材

层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹;洗脱液瓶(带下口的三角瓶,250m1);试管及试管架;量筒10m1;721型分光光度计

2.实验试剂

   (1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml,用浓醋酸调pH至7.0,加蒸馏水至1000m1。

   (2) 溴酚蓝溶液:称取溴酚蓝10毫克,溶于5毫升乙醇中,充分搅拌使其溶解,然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)至溶液呈深蓝色。

   (3) 蓝色葡聚糖—2000溶液:称取蓝色葡聚糖—2000  10毫克,溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液(pH7.0)中即成。

   (4) 样品溶液:取溴酚蓝溶液0.1毫升,蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液。

   (5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)

【实验操作】

1.实验凝胶的制备:商品凝胶是干燥的颗粒,使用时需经溶胀处理,称取4克葡聚糖凝胶G—25,加50毫升蒸馏水,搅拌均匀,在室温溶胀6小时,或沸水浴溶胀 2小时,一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒,用蒸馏水反复洗涤几次,再以缓冲溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗涤2—3次,使pH和离子强度达到平衡,最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡,凝胶可保存在缓冲液内。

    2.装柱:将层析柱洗净,垂直固定在铁支架上,选择有薄膜端作为层析柱下口,将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液,打开下口螺旋夹,让溶液流出,排除残留气泡,最后保留约2厘米高度的洗脱液,拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀,用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中,待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时,打开下口螺旋夹,继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡,尽可能一次装完,避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积,凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后,拧紧下端螺旋夹。

3.加样品:打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出,直至床面与液面刚好平齐为止,关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升,小心地加于凝胶表面上,切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口,使样品溶液进入凝胶内,并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时,关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区,共洗涤三次,每次清洗液应完全进入凝胶柱内后,再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液,保持高度为3—4cm。

    4.洗脱与收集:连接好凝胶柱层析系统,调节洗脱液流速为每分钟1毫升,进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象,收集洗脱液,每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号),收集约20管左右,样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。

    5.凝胶回收处理方法:将样品完全洗脱下来后,继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后,将柱下口放在小烧杯中,慢慢打开,再将上口慢慢松开,使凝胶全部回收至小烧杯中,备用。

 

 

 

 

 2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱, Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
   3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后,就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类:反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇--水系统最为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿--甲醇最为常见,先用50%氯仿--甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。
   4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大,这选用反相溶剂洗脱(甲醇--水),样品用最少体积的甲醇--水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样(一定要滤喔!要是把Sephadex LH20 堵啦,就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去,很心痛呀)。如果样品极性小,这选用正相溶剂洗脱(氯仿--甲醇),样品用最少体积的氯仿--甲醇溶解,过滤后,湿法上样。
   5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件:
梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统,用了很多年,效果较好。
(2) 饱和层析柱:
用洗脱剂将凝胶摇匀,直立柱身,让其自然沉降,此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关,流出几个柱体种的洗脱剂,目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。
(3) 样品处理:用尽量少的洗脱剂溶解样品,常压过滤。
(4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
(5) 洗脱:控制流速,一般1drop/s以下,可参见厂家的一些参数;必要时更改极性(很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕)。
再生以备下次使用。
   6 分离的技巧,最后说说我的使用心得
(1) 流速不可太快,切切不可新急,所谓欲速则不达。
(2)柱子尽可能长, Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力,打击敌人。
(3) 馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。
(4) 洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。
(5)鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质
(6)Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。
(7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用。


   Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成,属于分子筛凝胶,尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如:类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等,Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备,既可用于初步纯化步骤,也可用于最终精制步骤,如非对映同分异构体的分离。
   1.装柱
装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄),越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言,25~100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言,不能说分布均一,也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱(最高至250cm)而言也是同样的。在装柱前,层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。
Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中,要尽量避免过分搅拌,否则会破坏球形胶粒,且要避免使用磁力搅拌器。
在室温下,将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时,溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统,请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%,上层溶剂占25%,这时,悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内,在保证胶粒不变形的前提下,应在尽可能高的压力下装柱,反压不要超过1.5ba。
    2.平衡
上样前,用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止,如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质,并根据性质确定柱高调节器的位置,如使用相同的溶剂,在以后的层析中柱平衡可以省略。
    3.洗脱液
为确保延长层析柱的使用寿命,所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。
    4.样品
样品体积应该占柱总体积的1-2%,同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。
    5.洗脱
洗脱流速应根据情况而定,最大线性流速约12cm/min(反压1.5ba),建议流速为1-10cm/h。总体来说,较低的流速,具有较高的分辩率。

 


 

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