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常用液相色谱纯化方法
作者:蛋白质药…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2012-1-7          ★★★【字体:

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1、凝胶过滤(gel filtration,molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱,gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱)。
    根据分子大小和形状进行分离的一种方法,分子量(Stroke半径)较大的先出峰,分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列,此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强,目前广泛应用。
    凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
    要点: 采用细长(L/D~20)的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。
常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数:
系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用
Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白
Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米 <1078bp的DNA片断
Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米 <20000bp的质粒、巨大多糖、病毒
Sepharose FF系列 Sepharose 6 FF 10000~4000000 45~165微米 质粒、病毒
Sepharose 4 FF 60000~20000000 45~165微米 病毒,rHBsAg等巨大分子
Sepharose xB(CL-xB)系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物
Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子
Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物
Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物
Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120
Sephadex G-15 小于1500 40-120
Sephadex G-25
coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用
Sephadex G-25
medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25
fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25
superfine 1000-5000 10-40
Sephadex G-50
coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离
Sephadex G-50
medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50
fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50
superfine 1500-30000 10-40
Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
Sephadex G-75
superfine 3000-70000 10-40
Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G-100
superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-150
superfine 5000-150000 10-40
Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-200
superfine 5000-250000 10-40
2、离子交换色谱(ion exchange chromatography)
    蛋白质、多肽均属于两性电解质,在缓冲液pH小于其等电点时,带净正电荷,而在缓冲液pH大于其等电点时,带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团,阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上,再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱
    对于等电点小于5.0的酸性蛋白质,推荐使用阴离子交换,对于等电点大于7.0的碱性蛋白质,推荐使用阳离子交换。
    两种模式:一种使目的蛋白结合凝胶,通过梯度洗脱;一种使目的蛋白不结合凝胶,而大部分杂质结合凝胶,则穿过液中含有目的蛋白。
column chromatography(柱色谱)
batch chromatography(批色谱)
c、疏水作用色谱
    利用蛋白质、多肽在高盐存在下,可以结合疏水凝胶,而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。
d、亲和色谱
    利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如:酶-底物,酶-抑制剂,糖蛋白-凝集素,抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱,用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
    亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱(同一配基可以结合许多种蛋白质)。
e、反相色谱
    常用于蛋白质、多肽的HPLC分析,以及多肽的精细制备分离,分辨率极高,可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素(angiotensin)的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
    同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离,由于色谱条件进行了改变,色谱图截然不同,说明反相色谱具有高度的选择性。

应用举例
例一、一种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab片断(E.coli中表达)
分子量:50 kD
等电点:11
表达定位:周质(periplasmic)
纯化策略:渗透压休克提取周质,阳离子交换去除大部分杂质,疏水作用色谱进一步去除杂质,最后用凝胶过滤分离。
例二、重组表达的α-淀粉酶
分子量:49.2 kD;等电点:~6
先采用阴离子交换,再进行疏水作用色谱,最后进行凝胶过滤。
例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离
1、史克公司:(酵母细胞表达)
破碎细胞,表面活性剂抽提,离心沉淀、超滤,再经凝胶过滤、阴离子交换,超速离心纯化,脱盐,除菌过滤,吸附,分装。
2、Merck公司:(酵母细胞表达)
破碎细胞,去碎片,抗原用多孔硅玻璃吸附,洗脱,凝胶过滤,甲醛处理,明矾吸附,疫苗。
3、巴斯德研究所:(CHO细胞表达)
培养上清液,离心去碎片,50%硫酸铵沉淀,离心,50%KBr处理,脱盐、超滤浓缩、Sepharose CL-4B凝胶柱分离。
4、Below,M. Bioseparation. 1(1991). 397工艺
破细胞,去碎片,加硫酸铵至一定浓度后,直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水柱,脱盐后上DEAE-Sepharose FF,超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱。
例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离
(注射用降纤酶)
分子量:38 kD;等电点:~5.4
原工艺:阴离子交换,凝胶过滤,第二次阴离子交换,凝胶过滤
达到95%以上纯度,产量6000-10000单位/克蛇毒。(两周)
新工艺:亲和色谱,阴离子交换,凝胶过滤,亲和色谱(一周)
纯度达到98.5%以上,产量达20000-25000单位/克蛇毒。
尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后,获得了单成分降纤酶组分,电泳为一条带,HPLC为单峰。
如上图所示,由于每一个步骤均会带来一定的损失,故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤(在保证达到所需纯度的前提下)。


 

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