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高效液相色谱技术(HPLC)-下
作者:蛋白药动…    文章来源:www.yaodongxue.cn    点击数:    更新时间:2011-8-7          ★★★【字体:

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高效液相色谱技术(HPLC)-下

高效液相色谱仪的简易操作按照下面各步骤逐步操作:
一、打开检测器、系统控制器、计算机、采集器的电源
   检测器、系统控制器需要有一个预热过程(要等待30分钟左右)

二、样品分析方案的建立
    双击电脑屏幕上的“HS2000色谱工作站”——在窗口上方的菜单栏中点击“样品”——“新样品”——A通道,会发现软件窗口左上角出现“样品”,左键点击“样品”,按提示填写所需内容。
    a. 若需知道样品中各组分的百分比,选择“归一法”直接点击“完成”,方案即建立,等待高效液相进样后采集数据;
    b. 若需知道样品中各组分的含量,选择“外标法”,需先建立校正曲线,点击“完成”后,等待高效液相进样后采集数据。数据采集结束后,点击“采样结束”——确认——选定目标峰——赋予组分名——查看校正曲线;在“确认”窗口中,选择“检测样品”,再“确认”,即可检测未知样品的已知组分的含量。

三、检测器的设定
   在检测器控制器面板上,按上下方向键选择波长和灵敏度,输入需要的数值,按“Enter”键确认。

四、系统控制的设定
   等度分析:按“direct”设定A、B、C、D流动相的百分比,直接输入“flow rate”(0.8-1.5ml/min),按Enter 即可。
   梯度分析:按“program method”, 编辑梯度洗脱的程序,按“save”,保存到“program table”(1-15)中,按“operate method”, 输入你在“program table”中所保留的数字(1-15),再按“operate method”即可。

五、色谱泵和色谱柱的清洗
   色谱泵和色谱柱的清洗要用梯度清洗,保证色谱泵和色谱柱内无污染物。

六、排气和进样
   排气:若发现流动相输液管中有气泡或压力不稳定,将抽液阀调至“ draw”处,用注射器抽液直至气泡消失,之后将此阀调至“run”位。如长久不用,打开参考阀,排液10分钟。高液相开机后,一般都需要排液和抽液,以清除进液管道及泵中的空气。
进样: 用制备色谱(Semi-Prep)和分析色谱(Analytical)的控制阀,即高液相右下角的一个黑色旋钮,选择所需分析类型。如选择了分析型(Analytical)色谱分析,将分析旋钮调至“Load”位,用注射器注射一定量的溶剂,再将旋钮调至“Inject”位。此时,即可观察色谱分析的采集图谱。 

七、重复步骤五的操作,防止色谱泵和色谱柱的污染 
操作结束后详细填写设备使用记录
注意事项:
1、制备样品的浓度有经验值,在这个范围内检测灵敏度比较高。
2、使用前和使用后的两次色谱泵和色谱柱的清洗,一定要按照规定完成,决不能偷工减料。
3、进样针头的清洗,把抽屉里的白色塑料接头,接在注射器上,用100%甲醇象“进样”一样操作2-3次,以此来清洗进样器。

高效液相色谱仪操作步骤    1). 过滤流动相,根据需要选择不同的滤膜。
    2). 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
    3). 打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪),连接好流动相管道,连接检测系统。
    4). 进入HPLC控制界面主菜单,点击manual,进入手动菜单。
    5). 有一段时间没用,或者换了新的流动相,需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵,直接在泵的出水口,用
   针头抽取。冲洗进样阀,需要在manual菜单下,先点击purge,再点击start,冲洗时速度不要超过10ml/min。
    6). 调节流量,初次使用新的流动相,可以先试一下压力,流速越大,压力越大,一般不要超过2000。点击injure,选用合适的流速,点击on,走基线,观察基线的情况。
    7). 设计走样方法。点击file,选取select users and methods,可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法,点击new method。选取需要的配件,包括进样阀,泵,检测器等,根据需要而不同。选完后,点击protocol。一个完整的走样方法需要包括:a.进样前的稳流,一般2-5分钟;b.基线归零;c.进样阀的loading-inject转换;d.走样时间,随不同的样品而不同。
    8). 进样和进样后操作。选定走样方法,点击start。进样,所有的样品均需过滤。方法走完后,点击postrun,可记录数据和做标记等。全部样品走完后,再用上面的方法走一段基线,洗掉剩余物。
    9). 关机时,先关计算机,再关液相色谱。
 注意事项:
    1). 流动相均需色谱纯度,水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
    2). 柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要让液体过柱子。
    3). 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
    4). 压力不能太大,最好不要超过2000 psi。

高效液相色谱常见故障的断定及解决     (一)保留时间变化
         1.柱温变化 柱恒温,必要时需配置恒温箱
         2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
         3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液
         4.柱污染 每天冲洗柱
         5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
         6.柱快达到寿命 采用保护柱
     (二)保留时间缩短
        1.流速增加 检查泵,重新设定流速
        2.样品超载 降低样品量
        3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
        4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
        5.温度增加 柱恒温
      (三)保留时间延长
        1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
        2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
        3.键合相流失 同前(二)3
        4.流动相组成变化 同前(二)4
       5.温度降低 同前(二)5
     (四) 出现肩峰或分*
        1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
        2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
        3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
        4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
        5.进样器损坏 更换进样器转子
     (五)鬼峰
        1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
        2.样品中未知物 处理样品
        3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
        4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂
        5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水
     (六) 基线噪声
        1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
        2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
        3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
        4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
        5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
     (七)峰拖尾
        1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
        2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
        3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
        4.同前(四)4 同前(四)4
        5.同前(四)3 5.同前(四)3
        6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
        7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
      (八)峰展宽
        1.进样体积过大 同(四)1
        2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
        3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
        4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
        5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
        6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
        7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
        8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小
        9.样品过载 进小浓度小体积样品
高效液相色谱仪系统使用的常见问题及解决方法1 高效液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言,柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法
高效液相作为一种高精密仪器,如果在使用过程中不按照正确操作的话,就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1 柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方,柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI之间(在使用梯度洗脱时,柱压平稳缓慢的变化是允许的)。压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高 这是高效液相在使用中最常见的问题,指的是压力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时,我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处,此时PEEK管里充满液体,使PEEK管低于溶剂瓶,看液体是否自由滴下,如果液体不滴或缓慢滴下,则是溶剂过滤头堵塞。处理方法:用30%的硝酸浸泡半个小时,在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下,溶剂过滤头正常,在检查;
(2).打开Purge阀,使流动相不经过柱子,如果压力没有明显下降,则是过滤白头堵塞。处理方法:将过滤白头取出,用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI以下,过滤白头正常,在检查;
(3).把色谱柱出口端取下,如果压力不下降,则是柱子堵塞。处理方法:如果是缓冲盐堵塞,则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞,则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降,则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上,用流动相冲洗柱子。这时,如果柱压仍不下降,只有换柱子入口筛板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以尽量少用。 
2.1.1 压力过低 压力过低的现象一般是由于系统泄漏,处理方法:寻找各个接口处,特别是色谱柱两端的接口,把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气,但此时表现的往往是压力不稳,忽高忽低,更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法:打开Purge阀,用3~5ml/min的流速冲洗,如果不行,则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
2.2.漂移问题 主要包括基线漂移和保留时间漂移。
2.2.1基线漂移     一般说来,机器刚起动时,基线容易漂移,大概要半个小时的平衡时间,如果你用了缓冲溶液或缓冲盐,还有就是在低波长下(220nm)平衡时间相对会比较长,但如果你在实验过程中发现基线漂移,则你要考虑下面的原因:
1、柱温波动。解决方法:控制好柱子和流动相的温度,检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。 
2、流通池被污染或有气体。 解决方法:用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池(最好断开柱子)。如有需要,可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。
3、紫外灯能量不足。解决方法:更换新的紫外灯
4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法:检查流动相的组成,使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
5、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法:使用保护柱,如有必要,在进样之间。在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
6、检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法:将波长调整至最大吸收波长处
7、流动相的PH值没有调节好。解决方法:加适量的酸或碱调至最佳PH值
2.2.2保留时间漂移     保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志,同一种东西,两次的保留时间相差不要超过15s,超过了半分钟可看做保留时间漂移,就无法进行定性,你要考虑以下原因:
1、温控不当。解决方法:调好柱温,检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流动相比例变化。解决方法:检查四元泵的比例阀是否有故障
3、色谱柱没有平衡。解决方法:在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
4、流速变化。解决方法:重新设定流速
5、泵中有气泡。解决方法:、从泵中除去气泡
2.3 峰型异常问题 峰型问题是液相的主要问题,在做液相过程中,我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型,对于各种各样的异常峰,要区别对待,从主要问题出发,一个一个加以解决。 
1、色谱图中未出峰。解决方法:系统未进样或样品分解;泵未输液或流动相使用不正确;检测器设置不正确;针对以上情况成因作相应调整即可。
2、 一个峰或几个峰是负峰。解决方法:流动相吸收本底高;进样过程中进入空气;样品组分的吸收低于流动相。
3、 所有峰均为负峰。解决方法:信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒;光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。解决方法:系统未达到平衡;溶解样品的溶剂极性比流动相差很多;色谱柱尺寸及类型选择不正确;色谱柱或保护柱被污染或柱效降低;温度变化造成的影响。 、
5、所出峰比预想的小。解决方法:样品黏度过大;进样品故障或进样体积误差;检测器设置不正确.定量环体积不正确;检测池污染;检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。解决方法:进样量过大;样品浓度过高;保护柱或色谱柱柱头堵塞;保护拄或色谱柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。解决方法:进样量或样品浓度高;溶解样品的溶剂较流动相极性强;保护柱或色谱柱污染或失效。
8、拖尾峰。解决方法:柱超载,降低样品量;增加柱直径采用较高容量的固定相;峰干扰,对样品进行清洁过滤;调整流动相;硅羟基作用,加入三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值;柱内烧结不锈钢失效,更换烧结不锈钢;加在线过滤器,对样品进行过滤;死体积或柱外体积过大,将连接点降至最低;尽可能使用内径较细的连接管;柱效下降,更换柱子;采用保护柱,对柱子进行再生。
9、出现平头峰。解决方法:检测器设置不正确;进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。解决方法:进样阀残余峰,在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统;样品中存在未知物,改进样品的预处理;流动相污染,更换新流动相,尽可能现配现用,隔夜的流动相再次使用时要过滤;尽可能使用HPLC级试剂;流路中有小的气泡,打开Purge阀,加大流速排除。
HPLC的正确使用和科学保养    1、保持贮液瓶清洁,对专用贮液瓶应定期清洗;用试剂瓶作贮液瓶时,要经常更换。
    2、定期(如半个月)在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器,保持过滤器畅通无阻。
    3、使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相,所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长,对不是HPLC级的试剂要进行过滤(HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤)。对流动相一定要脱气。
    4、每天开始使用仪器,注意放空排气,确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。
    5、珍惜保护色谱柱,避免柱头突然产生大的波动,扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。
    6、采用保护(警戒)柱,延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头,造成柱压升高,柱效下降,峰形变差时,卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。
    7、避免超负荷进样,对250×4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下,应尽量将试样浓度降低,减少绝对进样量(进样体积可保持不变),这是保持HPLC柱性能持久良好的重要举措之一。
    8、经常用强溶剂冲洗柱子,将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇--二氯甲烷(1:1)冲洗,正相(硅胶柱)用纯甲醇或异丙醇冲洗,时间均不少于1h。
    9、做完试验,及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀,尤其是对过夜的柱子和进样阀,一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液,再用甲醇或乙腈冲洗,并保存在乙腈中。正相柱保存在非极性有机溶剂(如己烷)中。
    10、以硅胶为基质的柱子,如C-18、C-8等,要控制好流动相的pH值,一般不要低于2.5,不高于7.0。
    11、尽量用流动相溶解样品,一是避免出现拖尾峰、怪峰,二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。
    12、对于

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